«Красноярский государственный медицинский университет. Микроскопирование препаратов на малом и среднем увеличении Настройка микроскопа для работы при большом увеличении

В микроскопе для получения увеличенного изображения очень мелких объектов используется увеличительная способность выпуклых линз. На рис. П.2.3 изображен микроскоп с указанием деталей его строения. Микроскоп-дорогой прибор, поэтому необходимо обращаться с ним осторожно и не пренебрегать следующими правилами:

1. Храните микроскоп в ящике (или под колпаком), чтобы предохранить его от пыли.

2. Вынимайте его из ящика двумя руками и ставьте на место мягко, чтобы избежать сотрясения.

3. Линзы должны быть чистыми, для этого их необходимо протирать кусочком ткани.

4. Микроскоп всегда необходимо фокусировать, перемещая трубу вверх от препарата. В противном случае очень легко повредить препарат.

5. Держите открытыми оба глаза и смотрите ими по очереди.

Настройка микроскопа для работы при малом увеличении

1. Поставьте микроскоп на стол и сядьте в удобной позе. Исследуемый объект на предметном столике микроскопа должен быть освещен. Для этого пользуются специальным осветителем, светом из окна или от настольной лампы. В двух последних случаях используют вогнутую поверхность находящегося под предметным столиком зеркала. С помощью зеркала свет направляют через отверстие в предметном столике. Если имеется подходящий конденсор, то для направления света через него используют плоскую поверхность зеркала.

2. С помощью винта грубой настройки поднимите вверх тубус микроскопа и поворачивайте револьверную головку до тех пор, пока объектив с малым увеличением (× 10 или 16 мм) не попадет в паз тубуса (при этом раздается щелчок).

3. Положите препарат, который вы собираетесь рассматривать, на предметный столик микроскопа так, чтобы находящийся под покровным стеклом исследуемый материал находился над серединой отверстия в предметном столике.

4. Глядя на предметный столик и препарат сбоку, опускайте тубус с помощью винта грубой настройки до тех пор, пока объектив с малым увеличением не окажется примерно в 5 мм от препарата.

5. Глядя в микроскоп, поворачивайте винт грубой настройки до тех пор, пока объект не попадет в фокус.

Настройка микроскопа для работы при большом увеличении

1. При работе с объективом большого увеличения для создания достаточного освещения необходим искусственный свет. Для этого используют настольную лампу или специальный осветитель для микроскопа с матовой лампочкой. При работе с лампой накаливания необходимо между ней и микроскопом поместить лист бумаги. Поверните зеркало плоской поверхностью вверх так, чтобы свет, отражаясь, попадал в микроскоп.

2. Сфокусируйте конденсор, не убирая препарата с предметного столика. Поднимите конденсор так, чтобы расстояние между ним и предметным столиком было не более 5 мм. Глядя в микроскоп, поворачивайте винт грубой настройки до тех пор, пока объект не попадет в фокус. Теперь наводите фокус конденсора до тех пор, пока изображение лампы не наложится точно на препарат. Поместите конденсор несколько вне фокуса так, чтобы изображение лампы исчезло. Теперь освещение должно быть оптимальным. В конденсор вмонтирована диафрагма. Ею регулируют величину отверстия, через которое проходит свет. Это отверстие должно быть открыто как можно шире. Таким образом достигается максимальная четкость изображения (см. рис. П.2.3).

3. Поворачивайте револьверную головку до тех пор, пока объектив большого увеличения (× 40 или 4 мм) не попадет в паз. Если на малом увеличении фокус уже был установлен, то при повороте револьверной головки объектив большого увеличения автоматически установится приблизительно в фокусе. Фокусирование всегда производите движением объектива вверх с помощью винта тонкой настройки.

4. Если при движении объектива с линзами большого увеличения фокус не устанавливается, сделайте следующее: глядя на предметный столик сбоку, опускайте тубус микроскопа до тех пор, пока линза почти не коснется препарата. Следите за отражением линзы объектива на препарате и добивайтесь того, чтобы линза почти коснулась своего отражения.

5. Глядя в микроскоп и поворачивая винт тонкой настройки, медленно поднимайте объектив до тех пор, пока изображение не попадет в фокус.

Увеличение

Увеличение объекта под микроскопом происходит с помощью окуляра и линзы объектива (табл. П.2.1).

Масляная иммерсия

Для того чтобы получить более сильное увеличение, чем при работе с обычным объективом большого увеличения, необходимо использовать масляно-иммерсионную линзу. Способность линзы собирать свет в значительной степени усиливается, если между линзой объектива и покровным стеклом поместить жидкость. Жидкость должна иметь тот же коэффициент преломления, что и сама линза. Поэтому в качестве жидкости обычно используют кедровое масло.

1. Положите препарат на предметный столик и сфокусируйте изображение так же, как при работе с обычным большим увеличением. Вместо объектива с линзой большого увеличения установите объектив с масляно-иммерсионной линзой.

2. Капните каплю кедрового масла на покровное стекло непосредственно над исследуемым объектом.

3. Снова сфокусируйте изображение теперь уже под малым увеличением, затем поворотом револьверной головки установите объектив с масляно-иммерсионной линзой так, чтобы его кончик касался капли масла.

4. Глядя в микроскоп, очень осторожно сфокусируйте линзу с помощью винта тонкой настройки. Помните, что фокусная плоскость линзы находится всего в 1 мм от поверхности покровного стекла.

5. Кончив работу, сотрите с линзы масло мягкой тряпочкой.

имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого

Министерства здравоохранения

и социального развития Российской Федерации»

ГОУ ВПО КрасГМУ

им. проф. Войно-Ясенецкого

Факультет ФМО

Кафедра биологии с экологией и курсом фармакогнозии

Ситуационные задачи

по дисциплине «Биология с экологией»

для самоподготовки студентов первого курса

специальность 060101– Лечебное дело

специальность 060103 – Педиатрия

специальность 060105 - Стоматология

Красноярск 2009

полочный индекс

Ситуационные задачи по дисциплине «Биология с экологией»: методические разработки к внеаудиторной работе для студентов 1 курса обучающихся на факультете ФМО по специальностям: 060101- «Лечебное дело», 060103 – «Педиатрия», 060105- «Стоматология»:- Красноярск, типография КрасГМУ.-2009.- 35с.

Составители: зав. каф., доц., д.б.н. Т.Я.Орлянская, доц., к.б.н. М.Н.Максимова, доц., к.б.н. доц., к.б.н. В.А.Чиненков, доц. к.б.н. Л.С. Смирнова, асс. Г.П. Гаевская, асс. Н.Н. Дегерменджи, асс. Т.С.Подгрушная, асс. В.С.Крупкина, асс. Т.И.Устинова, асс. С.В. Чижова.

Под редакцией д-ра биол. наук. Т.Я. Орлянской.

Методическое руководство по предмету «Биология с экологией» для студентов первого курса содержат набор ситуационных задач по основным разделам дисциплины, которые ориентируют обучающихся на контроль знаний программного материала в процессе самоподготовки.

1. Ситуационные задачи по теме «Биология клетки»

1. Постоянный препарат изучен на малом увеличении, однако при переводе на большое увеличение объект не виден, даже при коррекции макро- и микрометрическим винтами и достаточном освещении. Необходимо определить, с чем это может быть связано?

Ответ : Причина может быть связана с тем, что препарат помещен на предметный столик неправильно: покровным стеклом вниз, а при работе на большом увеличении толщина предметного стекла не позволяет добиться точной наводки на фокус.

2. Препарат помещен на предметный столик микроскопа, имеющего в основании лапки штатива зеркало. В аудитории слабый искусственный свет. Объект хорошо виден на малом увеличении, однако при попытке его рассмотреть при увеличении объектива х40, в поле зрения объект не просматривается, видно темное пятно. Необходимо определить, с чем это может быть связано?

Ответ : Причин может быть несколько: 1 – для исследования использована плоская сторона зеркала, а комната недостаточно ярко освещена, поэтому объект при большом увеличении недостаточно освещен и не виден в поле зрения; 2 – возможно, движение револьвера было недостаточным, не доведен до щелчка, поэтому объектив не находится против объекта исследования; 3 – посмотреть как помещен на предметный столик препарат, возможно, он помещен покровным стеклом вниз.

3. Исследуемый препарат оказался поврежден: разбито предметное и покровное стекла. Объясните, как это могло произойти?

Ответ : Причина - неправильное обращение с макрометрическим винтом. Он опускает объектив к препарату. При работе с ним необходимо смотреть не в окуляр, а сбоку, контролируя расстояние от объектива к препарату, которое составляет в среднем 0,5см.

4. Общее увеличение микроскопа составляет при работе в одном случае - 280, а в другом - 900. Объясните, какие использованы объективы и окуляры в первом и во втором случаях и, какие объекты они позволяют изучать?

Ответ: В первом случае используется окуляр х7, а объектив х40, при данном увеличении можно рассмотреть крупные микрообъекты (н-р, клетки кожицы лука, клетки крови лягушки, перекрест волос); во втором случае используется окуляр х10, а объектив х90, при данном увеличении можно рассмотреть самые мелкие микрообъекты, используя при этом иммерсионное масло (органоиды клеток, колонии бактерий, мелкие клетки простейших, клетки крови человека).

5. Как надо расположить препарат, чтобы увидеть объект в нужном виде?

Ответ: Препарат необходимо расположить на предметный столик покровным стеклом вверх, объект должен располагаться в центре отверстия предметного столика, с учетом того, что изображение в микроскопе получаем обратное.

6. При ряде врожденных лизосомных «болезнях накопления» в клетках накапливается значительное количество вакуолей, содержащих нерасщепленные вещества. Например, при болезни Помпе происходит накопление гликогена в лизосомах. Объясните с чем связано данное явление, исходя из функциональной роли данного органоида клеток.

Ответ: Лизосомы в клетке участвуют в процессах внутриклеточного переваривания, они содержат около 40 гидролитических ферментов: протеазы, нуклеазы, гликозидазы, фосфорилазы и др. В данном случае в наборе ферментов отсутствует фермент кислой а-гликозидазы, участвующий в функционировании лизосом.

7. При патологических процессах обычно в клетках значительно увеличивается количество лизосом. На основании этого возникло представление, что лизосомы могут играть активную роль при гибели клеток. Однако известно, что при разрыве мембраны лизосом, выходящие гидролазы теряют свою активность, так как в цитоплазме слабощелочная среда. Объясните, какую роль играют лизосомы в данном случае, исходя из функциональной роли этого органоида в клетке.

Ответ: Одной из функций лизосом является автолиз или аутофагия. В настоящее время склонны считать, что процесс аутофагоцитоза связан с отбором и уничтожением измененных, «сломанных» клеточных компонентов. В данном случае лизосомы выполняют роль внутриклеточных чистильщиков, контролирующих дефектные структуры. В конкретном случае накопление лизосом и связано с выполнением ферментами этой функции - автолиз погибших клеток.

8. Объясните какие последствия могут ожидать животную клетку, у которой в клеточном центре отсутствуют одна центриоль и лучистая сфера (астросфера).

Центросомы обязательны для клеток животных, они принимают участие в формировании веретена деления и располагаются на полюсах, в неделящихся клетках определяют полярность клеток. При отсутствии данного органоида такая клетка не способна к пролиферации.

9. Обычно, если клеточная патология связана с отсутствием в клетках печени и почек пероксисом, то организм с таким заболеванием нежизнеспособен. Дайте объяснение этому факту, исходя из функциональной роли этого органоида в клетке.

Ответ: Микротельца или пероксисомы играют важную роль в метаболизме перекиси водорода, которая является сильнейшим внутриклеточным ядом и разрушает клеточные мембраны. В пероксисомах печени фермент каталаза составляет до 40% всех белков и выполняет защитную функцию. Вероятно, отсутствие данных ферментов, приводит к необратимым изменениям на уровне функционирования клеток, тканей и органов.

10. Объясните, почему у зимних спящих сурков и зимующих летучих мышей число митохондрий в клетках сердечной мышцы резко снижено.

Ответ: Количество митохондрий в клетках сердечной мышцы зависит от функциональной нагрузки на сердце и расхода энергии, которая вырабатывается и накапливается в макроэргических связях АТВ в «энергетических станциях» клеток, которыми являются митохондрии. В период спячки в организме животных процессы метаболизма замедленны и нагрузка на сердце минимальная.

11. Известно, что у позвоночных животных кровь красная, а у некоторых беспозвоночных (головоногих моллюсков) голубая. Объясните с присутствием, каких микроэлементов связан определенный цвет крови у этих животных?

Ответ: Кровь этих животных голубая т.к. в ее состав входит гемоцианин, содержащий медь (Си).

12.Зерна пшеницы и семена подсолнечника богаты органическими веществами. Объясните, почему качество муки связано с содержанием клейковины в ней, какие органические вещества находятся в клейковине пшеничной муки. Какие органические вещества находятся в семенах подсолнечника?

Ответ: Клейковина – это та часть муки, в которой содержится белковый компонент, благодаря которому качество муки ценится выше. В семенах подсолнечника наряду с белками и углеводами в значительном количестве находятся растительные жиры.

13. Восковидные липофусцинозы нейронов могут проявляться в разном возрасте (детском, юношеском и зрелом), относятся к истинным болезням накопления, связанным с нарушением функций органоидов мембранного строения, содержащих большое количество гидролитических ферментов. Симптоматика включает признаки поражения центральной нервной системы с атрофией головного мозга, присоединяются судорожные припадки. Диагноз ставится при электронной микроскопии - в этих органоидах клеток очень многих тканей обнаруживаются патологические включения. Объясните, в каком органоиде в клетках нарушена функция?

Ответ: у людей с данной патологией нарушена функция лизосом, возможно, какие-то ферменты отсутствуют или не включаются, поэтому в лизосомах обнаруживаются недорасщепленные структуры.

14. У больного выявлена редкая болезни накопления гликопротеинов, связанная с недостаточностью гидролаз, расщепляющих полисахаридные связи эти аномалии характеризуются неврологическими нарушениями и разнообразными соматическими проявлениями. Фукозидоз и маннозидоз чаще всего приводят к смерти в детском возрасте, тогда как аспартилглюкозаминурия проявляется как болезнь накопления с поздним началом, выраженной психической отсталостью и более продолжительным течением.

Объясните, в каком органоиде в клетках нарушена функция?

Ответ: у людей с данной патологией нарушена функция лизосом, отсутствуют ферменты, расщепляющие гликопротеины, поэтому в лизосомах обнаруживаются недорасщепленные структуры.

15. Выявлено наследственное заболевание, связанное с дефектами в функционирования органоида клетки приводящее к нарушениям энергетических функций в клетках - нарушению тканевого дыхания, синтеза специфических белков. Данное заболевание передается только по материнской линии к детям обеих полов. Объясните, в каком органоиде произошли изменения. Ответ обоснуйте.

Ответ: произошел дефект митохондриальной ДНК, идет неправильное считывание информации, нарушается синтез специфических белков, проявляются дефекты в различных звеньях цикла Кребса , в дыхательной цепи , что привело к развитию редкого митохондриального заболевания.

16.Ядро яйцеклетки и ядро сперматозоида имеет равное количество хромосом, но у яйцеклетки объём цитоплазмы и количество цитоплазматических органоидов больше, чем у сперматозоида. Одинаково ли содержание в этих клетках ДНК?

Ответ: У яйцеклетки содержание ДНК больше, за счёт наличия митохондриальный ДНК.

17. Гены, которые должны были включиться в работу в периоде G 2 , остались неактивными. Отразится ли это на ходе митоза?

Ответ: В период G 2 синтезируются белки, необходимые для образования нитей веретена деления. При их отсутствии расхождение хроматид в анафазу митоза нарушится или вообще не произойдёт.

18. В митоз вступила двуядерная клетка с диплоидными ядрами (2n=46). Какое количество наследственного материала будет иметь клетка в метафазе при формировании единого веретена деления, а также дочерние ядра по окончании митоза?

Ответ: В каждом из двух ядер, вступивших в митоз, хромосомы диплоидного набора уже содержат удвоенное количество генетического материала. Объем генетической информации в каждом ядре - 2 n 4с. В метафазе при формировании единого веретена деления эти наборы объединятся, и объем генетической информации составит, следовательно - 4 n 8с (тетраплоидный набор самоудвоенных или реплицированных хромосом).

В анафазе митоза этой клетки к полюсам дочерних клеток разойдутся хроматиды. По окончании митоза ядра дочерних клеток будут содержать объем генетической информации = 4 n 4с.

19. После оплодотворения образовалась зигота 46,ХХ, из которой должен сформироваться женский организм. Однако в ходе первого митотического деления (дробления) этой зиготы на два бластомера сестринские хроматиды одной из Х-хромосом, отделившись друг от друга, не разошлись по 2-м полюсам, а обе отошли к одному полюсу.

Расхождение хроматид другой Х-хромосомы произошло нормально. Все последующие митотические деления клеток в ходе эмбриогенеза протекали без нарушений механизма митоза, не внося дополнительных изменений, но и не исправляя изменённые наборы хромосом.

Каким будет хромосомный набор клеток индивида, развившегося из этой зиготы? Предположите, какими могут быть фенотипические особенности этого организма?

Ответ: Набор неполовых хромосом (аутосом) в обоих бластомерах будет нормальным и представлен диплоидным числом = 44 несамоудвоенных (нереплицированных) хромосом – бывших хроматид метафазных хромосом зиготы.

В результате клетки организма, развившегося из этой зиготы, будут иметь разный набор хромосом, то есть будет иметь место мозаицизм кариотипа: 45,Х / 47,ХХХ примерно в равных пропорциях.

Фенотипически это женщины, у которых наблюдаются признаки синдрома Шерешевского-Тернера с неярким клиническим проявлением.

20. После оплодотворения образовалась зигота 46,ХY, из которой должен сформироваться мужской организм. Однако в ходе первого митотического деления (дробления) этой зиготы на два бластомера сестринские хроматиды Y-хромосомы не разделились и вся эта самоудвоенная (реплицированная) метафазная хромосома отошла к одному из полюсов дочерних клеток (бластомеров).

Расхождение хроматид Х-хромосомы произошло нормально. Все последующие митотические деления клеток в ходе эмбриогенеза протекали без нарушений механизма митоза, не внося дополнительных изменений, но и не исправляя изменённые наборы хромосом.

Каким будет хромосомный набор клеток индивида, развившегося из этой зиготы? Предположите, какой фенотип может иметь этот индивид?

Ответ: Мозаицизм кариотипа: 45,Х / 46,Х Y (сокращенно – Х0/Х Y ) примерно в равных пропорциях. Фенотипические варианты при этом типе мозаицизма - 45,Х / 46,Х Y разнообразны. Такой индивид внешне может быть как мужского, так и женского пола. Описаны случаи гермафродитизма у лиц с мозаицизмом 45,Х / 46,Х Y , когда внешне организм был женского пола, но с правой стороны обнаруживалось яичко (семенник), над влагалищем – половой член и уретральное отверстие.

Задачи для самоконтроля

1. Постоянный препарат изучен на малом увеличении, однако при переводе на большое увеличение объект не виден, даже при коррекции макро- и микрометрическим винтами и достаточном освещении. Необходимо определить, с чем это может быть связано?

2. Препарат помещен на предметный столик микроскопа, имеющего в основании лапки штатива зеркало. В аудитории слабый искусственный свет. Объект хорошо виден на малом увеличении, однако при попытке его рассмотреть при увеличении объектива х40, в поле зрения объект не просматривается, видно темное пятно. Необходимо определить, с чем это может быть связано?

3. Исследуемый препарат оказался поврежден: разбито предметное и покровное стекла. Объясните, как это могло произойти?

4. Общее увеличение микроскопа составляет при работе в одном случае - 280, а в другом - 900. Объясните, какие использованы объективы и окуляры в первом и во втором случаях и, какие объекты они позволяют изучать?

5. Вам выдан постоянный препарат для исследования объекта при большом увеличении микроскопа. Как надо расположить препарат, чтобы увидеть объект при большом увеличении? Объясните, почему неправильные манипуляции с препаратом можно обнаружить только при большом увеличении.

6. Объясните, какие перспективы могут ожидать клетку эпителиальной ткани, у которой нет центриолей?

7. В диплоидной клетке произошла 7-кратная эндоредупликация.

Какое количество наследственного материала она имеет?

8. Одним из фундаментальных первоначальных выводов классической генетики является представление о равенстве мужского и женского пола в передаче потомству наследственной информации. Подтверждается ли этот вывод при сравнительном анализе всего объема наследственной информации, вносимого в зиготу сперматозоидом и яйцеклеткой?

9. После выхода клетки из митоза произошла мутация гена, несущего программу для синтеза фермента геликазы.

Как это событие отразится на митотическом цикле клетки?

1 0. После оплодотворения образовалась зигота 46,ХХ, из которой должен сформироваться женский организм. Однако в ходе первого митотического деления (дробления) этой зиготы на два бластомера одна из двух Х-хромосом не разделилась на две хроматиды и в анафазе целиком отошла к полюсу. Поведение второй Х-хромосомы прошло без отклонений от нормы. Все последующие митотические деления клеток в ходе эмбриогенеза протекали также без нарушений механизма митоза

Каким будет хромосомный набор клеток индивида, развившегося из этой зиготы и (предположительно) фенотипические особенности этого организма?

11. Общеизвестно, что однояйцовые (монозиготные) близнецы являются генетически идентичными. По фенотипу они, при нормальном ходе цитологических процессов их формирования и развития в одних и тех же условиях среды, похожи друг на друга «как две капли воды».

Могут ли монозиготные близнецы быть разного пола – мальчиком и девочкой? Если не могут, то почему? А если могут, то в результате, каких нарушений в митотическом цикле делящейся зиготы?

Биологические объекты можно исследовать как живыми, так и фиксированными. В последнем случае для более тщательного изучения материал можно разделить на части и обработать различными красителями, чтобы выявить и идентифицировать те или иные структуры. Из исследуемого объекта можно приготовить временные или постоянные препараты.

Фиксация препаратов

Фиксация - это сохранение материала в состоянии, близком к естественному. Для этого необходимо быстро умертвить ткани, что лучше всего достигается с небольшими кусочками живого материала. Используемое для этого вещество называется фиксатором. Быстрой фиксацией достигается сохранение изначальной структуры объекта, причем ткани уплотняются настолько, что с них можно готовить тонкие срезы.

Обезвоживание препаратов

Обезвоживание проводится при подготовке материала к заливке или для заключения его в соответствующую среду, которая не смешивается с водой. Воду необходимо удалить также потому, что иначе препарат будет со временем разрушен бактериями. Для того чтобы сохранить ультраструктуру, обезвоживание надо проводить постепенно, обрабатывая материал рядом водных растворов этанола или про-панона (ацетона) со все возрастающей концентрацией, и закончить обработку «абсолютным» (безводным) этанолом или пропаноном.

Просветление препаратов

Некоторые из общеупотребительных сред для заливки и заключения не смешиваются со спиртом . Поэтому его надо постепенно замещать средой (просветляющим веществом), с которой заливочная среда смешивается, например ксилолом. Это приводит также к тому, что материал становится прозрачным.

Заливка препаратов

Для того чтобы с помощью микротома получить очень тонкий срез, необходимо, чтобы материал был залит в соответствующую опорную среду . При приготовлении препаратов для световой микроскопии объекты заливают в парафин, которому затем дают остыть. Для электронной микроскопии приходится использовать более твердые вещества (пластмассы или смолы), поскольку здесь необходимы особо тонкие срезы, а значит, и опора должна быть более плотной.

Изготовление срезов препаратов

Как правило, толщина кусочков материала слишком велика, чтобы сквозь них могло пройти достаточное для исследования под микроскопом количество света. Обычно приходится срезать очень тонкий слой исследуемого материала, т. е. готовить срезы. Срезы можно делать бритвой или на микротоме. Вручную срезы готовятся с помощью остро отточенной бритвы. Для работы на обычном микроскопе срезы должны быть толщиной 8-12 мкм. Ткань закрепляют между двумя кусочками сердцевины бузины. Бритву смачивают жидкостью, в которой хранилась ткань; срез делают через бузину и ткань, причем бритву держат горизонтально и двигают ее к себе медленным скользящим движением, направленным чуть вкось. Быстро сделав несколько срезов, следует выбрать из них самый тонкий, содержащий характерные участки ткани.

Срез с ткани, залитой в ту или иную среду, можно сделать на микротоме. Для светового микроскопа срезы толщиной в несколько микрометров можно сделать с залитой в парафин ткани с помощью специального стального ножа. На ультратоме изготавливают чрезвычайно тонкие срезы (20-100 нм) для электронного микроскопа. В этом случае необходим алмазный или стеклянный нож.

Срезы для светового микроскопа можно приготовить, не заливая материал в среду; для этого используют замораживающий микротом. В процессе приготовления замороженного среза образец сохраняется в замороженном и, следовательно, в твердом состоянии.

Окрашивание препаратов

Как правило, биологические структуры на препаратах прозрачны , поэтому для получения контраста между ними приходится прибегать к различным средствам. Самым распространенным является окрашивание. Некоторые красители, используемые в световой микроскопии, перечислены в таблице.

Определенные красители в низких концентрациях не токсичны для живых тканей и поэтому могут применяться для окрашивания живого материала. Их называют прижизненными (витальными) красителями. К ним относятся, например, метиленовый синий и нейтральный красный.

При окрашивании парафиновых срезов парафин удаляют с помощью растворителя, а срез перед окрашиванием частично обводняют.

Полностью окрашенные срезы заключают на предметном стекле в специальную среду, например в канадский бальзам или эупарол; она не пропускает воздух, так что срез может сохраняться в ней неограниченно долго. Заключенный в среду срез накрывают покровным стеклом.

Последовательность описанных выше действий типична, когда речь идет о приготовлении тонких срезов для постоянных препаратов. Однако часто в порядок действий вносят два следующих изменения:

а) если срез сырого материала готовят вручную, то сначала делают срез, а потом его фиксируют;

б) окрашивать можно после фиксации или же в процессе обезвоживания на какой-либо его стадии. Например, красителем, растворенным в 50%-ном этаноле, можно окрасить срез после его обезвоживания в 50%-ном этаноле.

3- приготовленные лаборантом препарат является некачественным, т.к. содержит глыбки темно-коричневого цвета. Этот артефакт (зерна пигмента) образовался в результате реакции кислого формалина с гемоглобином.

4- Для удаления пигмента срезы необходимо поместить:

· в 1-5% раствор аммиака (на 15–20 мин),

· 70% спирт (на 15–20 мин),

· 1% КОН в 80° спирте (10 мин).

Затем срезы необходимо промыть водой.

Окрасив депарафинизированный срез гематоксилином, медицинский лабораторный техник остался недоволен результатом: фон препарата был тёмным, структура ядер не просматривалась.

ЗАДАНИЕ 1

1. Укажите, какой этап окраски препаратов был выполнен неудовлетворительно; подготовьте рабочее место для окраски препаратов
2. Подготовьте препарат к окрашиванию
3. Окрасьте препарат гематоксилином и эозином
4. Расскажите о правилах архивирования гистологических препаратов

1.Темный фон препарата и нечеткая структура ядер могут появиться при плохой дифференцировке препарата солянокислым спиртом.

2-3 депарафинирование и окраска препаратов гематоксилином-эозином

4. архивирование

После завершения вырезки кусочков из операционного материала, медицинский лабораторный техник поместил все инструменты, использованные перчатки и остатки материала в дезраствор.

ЗАДАНИЕ 1

1. Дайте оценку действиям лаборанта и подготовьте рабочее место для взятия операционного материала
2. Проведите маркировку и фиксацию материала
3. Проведите дезинфекцию использованной посуды и инструментария
4. Расскажите о правилах архивирования оставшегося после исследования материала (влажный архив)

1. Медицинский лабораторный техник поступил неверно. Оставшийся материал следует поместить в 10% нейтральный формалин (влажный архив).

2-3-взятие, маркировка и фиксация материала

4. влажный архив

Медицинский лабораторный техник получил задание залить в парафин операционный материал. С этой целью он использовал следующий алгоритм действий: спирт 70% - спирт 96% (1) – спирт 96% (2) - спирт 100% – ксилол (1) – ксилол (2) – смесь ксилола с парафином (при 37º С) – парафин (56º С).

2. Продемонстрируйте технику обезвоживания материала

3. Залейте материал в парафин

4. Расскажите о правилах архивирования парафиновых блоков

Медицинский лабораторный техник использовал правильный алгоритм действий

1-3 уплотнение материала и заливка его в парафин.

4.архивирование

При изготовлении парафиновых срезов с блока кожи с волосом медицинский лабораторный техник испытывал затруднение: срезы покрывались полосами, разрывались.

1. Назовите возможные причины затруднения в резке данного блока.

2. Возможно ли исправление этого артефакта?

3. Техника нанесения адгезивной среды на предметные стекла. Что можно использовать в качестве адгезивного материала при наклеивании срезов на предметные стекла?

1. Причинами возникновения разрывов и полос на парафиновых средах могут быть:

· Дефект режущей поверхности

· Налипание парафина на режущий край лезвия

· Некачественный парафин

2. Для устранения артефакта следует:

· Немного сдвинуть лезвие и посмотреть, изменилось ли вместе с этим расположение царапин на срезе. Если царапины тоже сместились, то замените лезвие.

· Очистите лезвие с помощью щётки, смоченной в ксилоле. Во время чистки щётку следует вести вверх по направлению от режущего края, но ни в коем случае не ведите её вниз на режущий край.

· Дубль образца следует подвергнуть декальцификации или перезалить материал.

3. В качестве адгезивного материала при наклеивании срезов на предметное стекло можно использовать готовый желатиновый адгезив для срезов или приготовить самостоятельно адгезивную среду на основе сыворотки или яичного белка с глицерином.

Приступив к окрашиванию парафинового среза с кусочка щитовидной железы, медицинский лабораторный техник забыл провести депарафинизацию.

1. Может ли быть окрашен недепарафинизированный препарат? С какой целью проводиться депарафинизация?

2. Возможна ли коррекция подобной ошибки?

3. Виды наиболее часто используемых гистологических красителей.

1. Недепарафинизированный препарат не может быть окрашен. Депарафинизация используется для удаления парафина из среза. Депарафинизированный препарат можно высушить и сохранять. Растворитель парафина – ксилол следует менять после обработки 100-200 срезов.

2. Коррекция невозможна.

3. В гистологической практике применяют основные (щелочные), кислотные и нейтральные красители. Основные красители окрашивают структуры кислой природы. В первую очередь ядра клеток (ДНК, хроматин, ядрышковая РНК). Это окрашивание называют базофильным. Среди этих красителей самый распространённый ядерный краситель – гематоксилин. Структуры цитоплазмы с основными свойствами окрашиваются кислыми красителями. Самый распространённый кислый краситель – эозин. Среди нейтральных красителей наиболее употребим краситель – Судан (Судан III, IV), растворяющийся в жирах. Его используют при выявлении жировых включений в цитоплазме клеток.

1. Постоянный препарат изучен на малом увеличении, однако при переводе на большое увеличение объект не виден, даже при коррекции макро- и микрометрическим винтами и достаточном освещении. Необходимо определить, с чем это может быть связано?

2. Препарат помещен на предметный столик микроскопа, имеющего в основании лапки штатива зеркало. В аудитории слабый искусственный свет. Объект хорошо виден на малом увеличении, однако при попытке его рассмотреть при увеличении объектива х40, в поле зрения объект не просматривается, видно темное пятно. Необходимо определить, с чем это может быть связано?

3. Исследуемый препарат оказался поврежден: разбито предметное и покровное стекла. Объясните, как это могло произойти?

4. Общее увеличение микроскопа составляет при работе в одном случае - 280, а в другом - 900. Объясните, какие использованы объективы и окуляры в первом и во втором случаях и, какие объекты они позволяют изучать?

5. Вам выдан постоянный препарат для исследования объекта при большом увеличении микроскопа. Как надо расположить препарат, чтобы увидеть объект при большом увеличении? Объясните, почему неправильные манипуляции с препаратом можно обнаружить только при большом увеличении.

6. Объясните, какие перспективы могут ожидать клетку эпителиальной ткани, у которой нет центриолей?

7. В диплоидной клетке произошла 7-кратная эндоредупликация.

Какое количество наследственного материала она имеет?

8. Одним из фундаментальных первоначальных выводов классической генетики является представление о равенстве мужского и женского пола в передаче потомству наследственной информации. Подтверждается ли этот вывод при сравнительном анализе всего объема наследственной информации, вносимого в зиготу сперматозоидом и яйцеклеткой?

9. После выхода клетки из митоза произошла мутация гена, несущего программу для синтеза фермента геликазы.

Как это событие отразится на митотическом цикле клетки?

10. После оплодотворения образовалась зигота 46,ХХ, из которой должен сформироваться женский организм. Однако в ходе первого митотического деления (дробления) этой зиготы на два бластомера одна из двух Х-хромосом не разделилась на две хроматиды и в анафазе целиком отошла к полюсу. Поведение второй Х-хромосомы прошло без отклонений от нормы. Все последующие митотические деления клеток в ходе эмбриогенеза протекали также без нарушений механизма митоза

Каким будет хромосомный набор клеток индивида, развившегося из этой зиготы и (предположительно) фенотипические особенности этого организма?

11. Общеизвестно, что однояйцовые (монозиготные) близнецы являются генетически идентичными. По фенотипу они, при нормальном ходе цитологических процессов их формирования и развития в одних и тех же условиях среды, похожи друг на друга «как две капли воды».

Могут ли монозиготные близнецы быть разного пола – мальчиком и девочкой? Если не могут, то почему? А если могут, то в результате, каких нарушений в митотическом цикле делящейся зиготы?

2. Ситуационные задачи по теме «Молекулярные основы наследственности и изменчивости»

Геном – общие вопросы

1. Объясните причину ситуации, при которой ген эукариотической клетки, занимающий участок ДНК размером в 2400 пар нуклеотидов, кодирует полипептид, состоящий из 180 аминокислотных остатков.

Ответ: Для кодирования 180 аминокислотных остатков достаточно 540 нуклеотидов (180 триплетов) матричной цепи ДНК. Плюс столько же – кодирующая цепь. Итого – 1080 нуклеотидов или 540 пар нуклеотидов.

2. При анализе нуклеотидного состава ДНК бактериофага М 13 было обнаружено следующее количественное соотношение азотистых оснований: А-23%, Г-21%, Т-36%, Ц-20%. Как можно объяснить причину того, что в этом случае не соблюдается принцип эквивалентности, установленный Чаргаффом?

Ответ: Причина в том, что бактериофаг М13 (как и большинство фагов) содержит одноцепочечную ДНК.